دانشمندان اولین سیستم کریسپر هدایت‌شونده با DNA در جهان را توسعه دادند؛ انقلابی در دقت ویرایش ژن و تشخیص بیماری‌ها

برای بیش از یک دهه، ابزار انقلابی ویرایش ژن کریسپر بر اساس یک فرض واحد و اساسی عمل کرده است: اینکه باید توسط RNA هدایت شود. این قانون بیولوژیکی هزاران پیشرفت را به دنبال داشته است، اما به دلیل شکنندگی ذاتی RNA و هزینه‌های بالای تولید، محدودیت‌های سختی را نیز تحمیل کرده است. اکنون، تیمی از مهندسان در دانشگاه فلوریدا (University of Florida) با موفقیت این الگو را دگرگون کرده‌اند.[1][2][7]

در مطالعه‌ای که در نشریه «Nature Biotechnology» منتشر شد، محققان از اولین سیستم کریسپر جهان رونمایی کردند که به طور کامل توسط DNA هدایت می‌شود. با جایگزینی راهنمای شکننده RNA با یک معادل DNA بادوام، این تیم پلتفرمی را مهندسی کرده است که ارزان‌تر، به طور چشمگیری پایدارتر و قادر به دقتی بی‌سابقه است.[1][3][5][6]

این پیشرفت نشان‌دهنده یک تغییر اساسی در نحوه تعامل دانشمندان با ژنوم و ترانسکریپتوم انسان است. به جای استفاده از کریسپر برای ایجاد برش‌های دائمی و برگشت‌ناپذیر در طرح اصلی DNA سلول، این سیستم جدید از یک راهنمای DNA برای جستجو و تنظیم RNA استفاده می‌کند—که همان «نسخه‌های کاری» موقت دستورالعمل‌های ژنتیکی هستند.[2][3][5][8]

پیوش جین (Piyush Jain)، نویسنده اصلی این مطالعه و دانشیار مهندسی شیمی در دانشگاه فلوریدا، توضیح داد: «این روش راهی به ما می‌دهد تا دستورالعمل‌هایی را که سلول در زمان واقعی استفاده می‌کند، اصلاح یا تنظیم کنیم، بدون اینکه بلافاصله DNA را تغییر دهیم.» این رویکرد برگشت‌پذیر، یک حاشیه ایمنی حیاتی برای درمان‌های آینده فراهم می‌کند و به پزشکان اجازه می‌دهد تا فعالیت‌های بیماری‌زا را کاهش دهند، بدون اینکه خطر جهش‌های دائمی خارج از هدف (off-target) را به همراه داشته باشد.[2][5][6][7]

برای درک بزرگی این تغییر، لازم است به مکانیک کریسپر سنتی نگاه کنیم. سیستم‌های متداول، مانند CRISPR-Cas9، برای پیمایش در محیط سلولی و یافتن یک توالی خاص از DNA برای ویرایش، به یک قطعه کوچک از RNA راهنما متکی هستند. اگرچه مولکول‌های RNA بسیار مؤثرند، اما به طور بدنامی ناپایدار هستند؛ آنها به سرعت در دمای اتاق تجزیه می‌شوند و نیاز به سنتز پیچیده و گران قیمت دارند.[3][4][8]

تیم فلوریدا با طراحی یک راهنمای مصنوعی مبتنی بر DNA، که ΨDNA نامیده می‌شود، این گلوگاه را دور زد. هنگامی که این راهنما با آنزیم Cas12—نوعی از پروتئین سنتی کریسپر—جفت می‌شود، ΨDNA با موفقیت در سلول حرکت می‌کند تا اهداف RNA خاص را پیدا کند. از آنجایی که DNA به طور طبیعی قوی است، این راهنماها می‌توانند برای مدت طولانی‌تری ذخیره شوند، با کسری از هزینه تولید گردند و با اطمینان بیشتری در محیط‌های بالینی به کار گرفته شوند.[1][3][4][7]

توانایی این سیستم در هدف قرار دادن RNA به جای DNA، مسیرهای درمانی کاملاً جدیدی را، به ویژه در انکولوژی (سرطان‌شناسی)، باز می‌کند. در آزمایش‌های آزمایشگاهی، محققان سیستم هدایت‌شونده با ΨDNA را علیه چندین رده سلولی سرطان انسانی، از جمله HeLa (سرطان دهانه رحم)، HepG2 (سرطان کبد) و MCF-7 (سرطان سینه) به کار گرفتند.[3]

نتایج، کارایی عمیقی را نشان داد. در آزمایش‌های استاندارد، راهنماهای DNA سطح RNA بیماری‌زای هدف‌گذاری شده را بین ۵۰ تا ۷۰ درصد کاهش دادند. هنگامی که سیستم‌های سلولی بیشتر بهینه‌سازی شدند، این کاهش به ۸۰ تا ۹۵ درصد رسید و عملاً دستورالعمل‌های ژنتیکی مضری را که سلول‌های سرطانی را هدایت می‌کردند، خاموش کرد.[3]

نکته جالب اینجاست که این سیستم بدون اینکه به عنوان یک ابزار خشن عمل کند، به این هدف دست می‌یابد. به جای قطع مستقیم RNA هدف، مجموعه ΨDNA-Cas12 به RNA متصل می‌شود و ماشین‌آلات پروتئین‌سازی سلول را مسدود می‌کند. این انسداد به طور طبیعی مسیرهای تخریب داخلی خود سلول را فعال می‌کند و سلول را وادار می‌سازد تا RNA ناخواسته را به طور ایمن از بین برده و پاکسازی کند.[3]

فراتر از درمان، پایداری راهنماهای DNA بلافاصله این فناوری را به عنوان یک نیروی قدرتمند برای تشخیص بیماری‌های عفونی مطرح کرده است. ابزارهای تشخیصی مبتنی بر RNA فعلی نیاز به ذخیره‌سازی دقیق در زنجیره سرد و محیط‌های بسیار کنترل شده دارند تا از تجزیه مولکول‌های راهنما قبل از انجام آزمایش جلوگیری کنند.[3][4][5][7]

پلتفرم هدایت‌شونده با DNA بخش زیادی از این اصطکاک لجستیکی را از بین می‌برد. در آزمایش نمونه‌های بالینی، سیستم جدید کریسپر با پیروی از یک جریان کاری مبتنی بر تقویت، ویروس هپاتیت C را با دقت ۱۰۰٪ تشخیص داد. محققان همچنین گزارش دادند که این پلتفرم، تشخیص HIV را در مقایسه با پروتکل‌های آزمایش استاندارد، به طور قابل توجهی زودتر امکان‌پذیر ساخت.[3][5][6]

دقت راهنماهای ΨDNA همچنین به نظر می‌رسد یکی از پایدارترین چالش‌های کریسپر، یعنی اثرات خارج از هدف (off-target effects)، را حل می‌کند. از آنجایی که راهنمای DNA با خواص ترمودینامیکی متفاوتی نسبت به RNA به هدف خود متصل می‌شود، تیم تحقیقاتی گزارش داد که تعاملات ناخواسته در برخی سناریوها به میزان قابل توجهی کاهش یافته است. در صورت تأیید در آزمایش‌های انسانی، این امر می‌تواند خطر عوارض جانبی در ژن‌درمانی‌ها را به شدت کاهش دهد.[2][7]

با وجود موفقیت چشمگیر آزمایشگاهی، این فناوری هنوز در مراحل اولیه خود قرار دارد. داده‌های فعلی کاملاً متکی بر رده‌های سلولی جدا شده و نمونه‌های بالینی «برون‌تنی» (ex vivo) هستند. تبدیل این نتایج به درمان‌های «درون‌تنی» (in vivo)—جایی که سیستم کریسپر مستقیماً به بیمار زنده تزریق می‌شود—مستلزم غلبه بر موانع مهم تحویل است.[3][5]

رساندن ایمن آنزیم Cas12 و راهنمای ΨDNA آن به اندام‌های خاص بدون ایجاد پاسخ ایمنی، همچنان یک چالش مهندسی پیچیده است. آژانس‌های فدرال، از جمله مؤسسات ملی بهداشت (NIH) و آژانس پروژه‌های تحقیقاتی پیشرفته برای سلامت (ARPA-H)، در حال حاضر تلاش‌های گسترده‌تری را برای حل این گلوگاه‌های تحویل برای ویرایشگرهای ژنی نسل بعدی تأمین مالی می‌کنند.[3][5]

تأیید نظارتی برای کاربردهای درون‌تنی احتمالاً سال‌ها فاصله دارد و مستلزم مدل‌سازی گسترده حیوانی و آزمایش‌های انسانی مرحله‌بندی شده است. با این حال، محققان پیش‌بینی می‌کنند که کاربردهای برون‌تنی—جایی که سلول‌های بیمار استخراج، در آزمایشگاه با استفاده از سیستم هدایت‌شونده با DNA اصلاح و سپس مجدداً تزریق می‌شوند—می‌توانند خیلی زودتر وارد خطوط لوله بالینی شوند.[5][6]

با بازنویسی اساسی قوانین ناوبری کریسپر، توسعه سیستم‌های هدایت‌شونده با DNA نقطه بلوغی را برای مهندسی ژنتیک رقم می‌زند. این امر، حوزه را از اتکای صرف به ویرایش‌های دائمی و پرخطر DNA به سمت آینده‌ای از تنظیم RNA پایدار، برگشت‌پذیر و بسیار دقیق سوق می‌دهد.[2][3][4][8]