ویرایشگر ژنی جدید محدودیت اندازه کریسپر را برطرف می‌کند و امکان ویرایش میلیون‌ها جفت باز را برای اختلالات ژنی بزرگ فراهم می‌سازد.

وعده کریسپر همواره با یک محدودیت فیزیکی اساسی همراه بوده است: این فناوری یک چاقوی جراحی مولکولی است، نه یک کامیون حمل بار. در حالی که کریسپر-Cas9 سنتی در بریدن حروف منفرد یا انجام ویرایش‌های کوچک و موضعی عالی عمل می‌کند، برای وارد کردن توالی‌های بزرگ DNA با مشکل مواجه است. این محدودیت محموله عملاً راه درمان برخی از مخرب‌ترین بیماری‌های ژنتیکی، معروف به اختلالات ژنی بزرگ، را که در آن‌ها هزاران یا حتی میلیون‌ها جفت باز از دست رفته یا به شدت جهش یافته‌اند، مسدود کرده است.[7]

اکنون، نسل جدیدی از فناوری‌های ویرایش ژن در حال غلبه بر این مانع هستند و پارادایم را از پردازش کلمه مولکولی به بازنویسی کامل کروموزومی تغییر می‌دهند. پیشرفت‌های اخیر توانایی دستکاری بخش‌های DNA با طول ده‌ها هزار تا بیش از یک میلیون جفت باز را نشان داده‌اند. محققان با کنار گذاشتن مکانیسم سنتی شکست دو رشته‌ای کریسپر و روی آوردن به نوترکیب‌کننده‌های (recombinases) قابل برنامه‌ریزی و تکنیک‌های «مونتاژ پرایم» (prime assembly)، پتانسیل جایگزینی کامل ژن‌های معیوب را در یک مداخله واحد آزاد می‌کنند.[1][2][4][5]

اهمیت این جهش تکنولوژیک بسیار زیاد است. بیماری‌هایی مانند دیستروفی عضلانی دوشن (DMD) و فیبروز سیستیک ناشی از جهش‌هایی هستند که در سراسر ژن‌های بزرگ پراکنده شده‌اند. ژن دیستروفین، که در DMD نقش دارد، به طور حیرت‌انگیزی ۲.۴ میلیون جفت باز را در بر می‌گیرد. کریسپر سنتی نمی‌تواند به راحتی ژنی با این عظمت را جایگزین کند؛ بلکه تنها می‌تواند تلاش کند تا خطاهای کوچک و خاص را ترمیم کند، که نیازمند درمان‌های سفارشی برای جهش‌های مختلف بیماران است. با این حال، یک ویرایشگر با قابلیت ویرایش یک میلیون جفت باز، می‌تواند از لحاظ نظری کل ژن معیوب را با یک نسخه سالم جایگزین کند و درمانی جهانی را برای همه بیماران مبتلا به این بیماری، صرف نظر از مشخصات جهش خاص آن‌ها، ارائه دهد.[7]

پایه و اساس این عصر جدید با کشف نوترکیب‌کننده‌های پل (bridge recombinases) گذاشته شد، مکانیسمی که توسط محققان در مؤسسه آرک (Arc Institute) شناسایی شد. برخلاف کریسپر، که از یک RNA راهنما برای یافتن هدف استفاده می‌کند و سپس برای ترمیم برش به ماشین‌آلات ترمیم اغلب غیرقابل پیش‌بینی سلول متکی است، نوترکیب‌کننده‌های پل از یک RNA پل تخصصی استفاده می‌کنند که به دو حلقه تا می‌شود. یک حلقه به DNA هدف در ژنوم متصل می‌شود، در حالی که حلقه دیگر به توالی DNA اهداکننده که قرار است وارد شود، متصل می‌گردد.[1][4]

این مکانیسم اتصال دوگانه به آنزیم اجازه می‌دهد تا دو رشته DNA را به طور فیزیکی به هم نزدیک کرده و آن‌ها را به طور یکپارچه نوترکیب کند. نکته حیاتی این است که این فرآیند باعث ایجاد شکست‌های دو رشته‌ای نمی‌شود، شکست‌هایی که عامل جهش‌های ناخواسته و سمیت سلولی هستند. در نسخه‌های مهندسی شده این سیستم، محققان با موفقیت توانایی انجام ویرایش‌های دقیق با طولی نزدیک به یک میلیون جفت باز را در سلول‌های انسانی نشان داده‌اند. این امر عملاً پنجره ویرایش را گسترش می‌دهد تا کل ژن‌ها، عناصر تنظیمی طولانی و حتی خانواده‌های ژنی خوشه‌ای را در بر گیرد.[1][4]

دانشمندان بر اساس نیاز به ویرایش‌های بزرگتر، اخیراً روشی به نام مهندسی کروموزومی قابل برنامه‌ریزی (PCE) را معرفی کردند. این تکنیک چندین استراتژی ویرایش نوآورانه را برای دستکاری بخش‌های DNA از هزاران تا میلیون‌ها جفت باز در سلول‌های گیاهی و حیوانی ترکیب می‌کند. سیستم PCE فراتر از جایگزینی ساده ژن عمل می‌کند و امکان بازآرایی ساختاری در مقیاس مگاباز را فراهم می‌سازد.[2]

در آزمایش‌های آزمایشگاهی، سیستم PCE به شاهکارهای بی‌سابقه‌ای در معماری ژنومی دست یافت. محققان با موفقیت یک قطعه DNA با ۱۸,۸۰۰ جفت باز را وارد کردند، یک ناحیه کروموزومی ۱۲ میلیون جفت بازی را معکوس (inverted) کردند و یک بخش ۴ میلیون جفت بازی را حذف نمودند. آن‌ها حتی توانایی جابجایی کل کروموزوم‌ها را نشان دادند. این سطح از کنترل ساختاری یک جهش بزرگ رو به جلو است و پتانسیل اصلاح ناهنجاری‌های کروموزومی در مقیاس بزرگ را ارائه می‌دهد که باعث سندرم‌های مادرزادی پیچیده‌ای می‌شوند که از لحاظ تاریخی کاملاً غیرقابل درمان تلقی می‌شدند.[2][7]

یکی دیگر از موانع حیاتی در ژن‌درمانی، ویرایش سلول‌هایی است که دیگر تقسیم نمی‌شوند، مانند نورون‌های مغز یا سلول‌های ماهیچه‌ای قلب. کریسپر سنتی به شدت به ترمیم هدایت‌شده توسط همولوژی (homology-directed repair) متکی است، مسیری سلولی که تنها در طول تقسیم سلولی فعال است. برای دور زدن این مشکل، محققان «مونتاژ پرایم» (prime assembly) را توسعه دادند، تکنیکی که ویرایش پرایم را با اصول مونتاژ گیبسون (Gibson assembly) ادغام می‌کند تا قطعات به اندازه ژن را در سلول‌های غیرقابل تقسیم به هم بدوزد.[5]

مونتاژ پرایم از یک استراتژی ویرایش پرایم دوقلو برای ایجاد فلپ‌های DNA تک‌رشته‌ای مکمل در محل هدف استفاده می‌کند. این فلپ‌ها به عنوان ایستگاه‌های اتصال عمل می‌کنند و ورود توالی‌های بزرگ DNA اهداکننده را بدون نیاز به شکست کامل دو رشته‌ای هدایت می‌کنند. این سیستم با موفقیت توالی‌های DNA به بزرگی ۱۱,۰۰۰ جفت باز – که به اندازه بسیاری از ژن‌های کامل انسانی نزدیک است – را مستقیماً در سلول‌های غیرقابل تقسیم وارد کرده است. این امر افق درمانی را گسترش می‌دهد تا اختلالات عصبی و دیستروفی‌های عضلانی را که در بافت‌های پس از میتوز (post-mitotic) قرار دارند، در بر گیرد.[5]

حتی قوی‌ترین ویرایشگر ژن نیز اگر نتواند به سلول‌های بیمار منتقل شود، بی‌فایده است. استاندارد طلایی برای انتقال ژن‌درمانی در داخل بدن (in vivo)، ویروس مرتبط با آدنو (AAV) است که به دلیل ایمنی و توانایی هدف قرار دادن بافت‌های خاص، بسیار ارزشمند است. با این حال، AAVها محدودیت محموله سختگیرانه‌ای در حدود ۴,۷۰۰ جفت باز دارند. آنزیم استاندارد کریسپر-Cas9، به همراه RNA راهنمای خود، به سختی در داخل آن جای می‌گیرد و فضایی برای توالی DNA اهداکننده که قرار است جایگزین ژن معیوب شود، باقی نمی‌گذارد.[6]

برای حل این مشکل، محققان به سیستم‌های ویرایش فوق‌فشرده روی آورده‌اند. سیستم TIGR (RNA راهنمای فاصله‌دار پشت سر هم) که اخیراً توسعه یافته است، از پروتئین‌هایی استفاده می‌کند که تقریباً یک چهارم اندازه Cas9 هستند. از آنجایی که TIGR بسیار کوچک است، به راحتی در کنار یک محموله قابل توجه از DNA اهداکننده در داخل AAV جای می‌گیرد. علاوه بر این، TIGR برای اتصال به DNA نیازی به توالی PAM خاصی ندارد، که از لحاظ نظری به آن اجازه می‌دهد تا هر مکانی را در ژنوم انسان با دقت بالا هدف قرار دهد.[3][6]

دانشمندان با کوچک کردن قیچی‌های مولکولی، فضای ارزشمند محموله ویروسی را برای انتقال توالی‌های ژنی بزرگ و سالم مورد نیاز برای درمان اختلالات پیچیده آزاد می‌کنند. این هم‌افزایی بین ویرایشگرهای فشرده و تکنیک‌های وارد کردن محموله بزرگ به این معنی است که محدودیت‌های فیزیکی انتقال ویروسی دیگر مانع مطلق برای درمان‌های جایگزینی کل ژن نیستند.[7]

در حالی که توانایی وارد کردن میلیون‌ها جفت باز انقلابی است، ابعاد جدیدی از خطر و عدم قطعیت آشکار را نیز معرفی می‌کند. هرچه توالی DNA که وارد یا معکوس می‌شود بزرگتر باشد، پتانسیل بیشتری برای برهم زدن تاخوردگی سه‌بعدی ظریف ژنوم وجود دارد. کروموزوم‌ها ساختارهای فشرده‌ای هستند و بازآرایی‌های عظیم می‌توانند ناخواسته ژن‌های سالم همسایه را خاموش کرده یا انکوژن‌ها (ژن‌های سرطان‌زا) را فعال کنند و به طور بالقوه باعث ایجاد سرطان شوند.[7]

علاوه بر این، کارایی این ویرایش‌های در مقیاس بزرگ در موجودات زنده هنوز از عملکرد آن‌ها در سلول‌های آزمایشگاهی جدا شده عقب‌تر است. در حالی که ویرایش یک میلیون جفت باز در یک ظرف پتری امکان‌پذیر است، دستیابی به آستانه درمانی لازم – ویرایش تعداد کافی سلول در کبد، ماهیچه یا مغز بیمار برای معکوس کردن یک بیماری – همچنان یک چالش مهندسی زیستی بزرگ است. پاسخ سیستم ایمنی بدن به این پروتئین‌های نوترکیب جدید، که بسیاری از آن‌ها از باکتری‌ها و ویروس‌ها مشتق شده‌اند، نیز باید در کارآزمایی‌های بالینی طولانی‌مدت به دقت ارزیابی شود.[7]

با وجود این موانع، گذار از ویرایش جهش نقطه‌ای به جایگزینی کامل ژن، نقطه عطفی در پزشکی ژنتیک محسوب می‌شود. برای خانواده‌هایی که تحت تأثیر اختلالات ژنی بزرگ قرار گرفته‌اند، چشم‌انداز یک ژن‌درمانی جایگزین «یک اندازه برای همه» تغییر عمیقی در پیش‌آگهی ایجاد می‌کند. به جای توسعه صدها درمان سفارشی کریسپر برای هر جهش منحصر به فرد در ژنی مانند دیستروفین، یک ویرایشگر واحد با قابلیت ویرایش میلیون‌ها جفت باز می‌تواند یک بازنشانی ژنتیکی جهانی ارائه دهد و کد زندگی را در مقیاسی بازنویسی کند که قبلاً غیرممکن تصور می‌شد.[7]