چگونه یک توالی ۲۰ نوکلئوتیدی RNA راهنما، نوکلئاز Cas9 را به یک جایگاه ژنومی خاص هدایت می‌کند

یک مهندس زیستی که در حال طراحی یک مداخله کریسپر-کَس۹ (CRISPR-Cas9) است، دقیقاً یک متغیر را برای تعیین محل برش ژنوم توسط آنزیم کنترل می‌کند: یک توالی ۲۰ نوکلئوتیدی از RNA راهنما. پژوهشگران با سنتز این رشته کوتاه از حروف ژنتیکی برای تطبیق با یک جایگاه هدف، مکان دقیقی را دیکته می‌کنند که نوکلئاز Cas9 به آن متصل شده، مارپیچ دوگانه DNA را باز کرده و هر دو رشته را قطع می‌کند. این آنزیم تنها پس از برخورد با یک نقطه بازرسی مولکولی سه‌حرفی خاص، این برش را اجرا می‌کند؛ در این نقطه، RNA راهنما روی مکمل خود قفل شده و فرآیند برش را آغاز می‌کند.

پایه و اساس این سیستم قابل‌برنامه‌ریزی در سال ۲۰۱۲ بنا شد، زمانی که پژوهشگران نشان دادند دو مولکول RNA مجزا که توسط سیستم‌های ایمنی باکتریایی استفاده می‌شوند، می‌توانند در یک مولکول ادغام شوند. این تیم در مقاله برجسته خود گزارش داد: «ما نشان می‌دهیم که dual-tracrRNA:crRNA، زمانی که به عنوان یک کایمرای RNA واحد مهندسی می‌شود، برش dsDNA توسط Cas9 را نیز به صورت توالی-ویژه هدایت می‌کند.» این RNA راهنمای منفرد (sgRNA) مکانیسم تحویل را ساده کرد و برای اجرای یک ویرایش ژنومی دقیق، تنها به پروتئین Cas9 و رشته RNA مصنوعی نیاز داشت.[1][2]

معماری فیزیکی این مکانیسم هدف‌گیری به یک توالی دقیق از رویدادها متکی است که با «نقش مجاور فاصله انداز» (PAM) آغاز می‌شود. آنزیم Cas9 نوع وحشی از باکتری استرپتوکوکوس پیوژنز (SpCas9) نمی‌تواند تنها بر اساس توالی RNA راهنما به DNA متصل شود؛ بلکه ابتدا باید به صورت فیزیکی با یک توالی PAM، به طور خاص نوکلئوتیدهای NGG (که در آن N هر بازی می‌تواند باشد)، تعامل کند. این الزام به عنوان یک سیستم ایمنی عمل می‌کند و از برش بی‌رویه ژنوم میزبان توسط آنزیم جلوگیری می‌کند.[1][6]

هنگامی که SpCas9 موتیف NGG را شناسایی می‌کند، آنزیم باعث ذوب شدن موضعی مارپیچ دوگانه DNA می‌شود. این باز شدن، رشته هدف را در معرض دید قرار می‌دهد و به RNA راهنمای ۲۰ نوکلئوتیدی اجازه می‌دهد تا جفت شدن بازها را آغاز کند. این جفت شدن از «ناحیه بذر» (seed region) — شامل ۱۰ تا ۱۲ نوکلئوتید که دقیقاً در مجاورت PAM قرار دارند — آغاز شده و به سمت بیرون زیپ می‌شود. اگر ناحیه بذر کاملاً با DNA مطابقت داشته باشد، آنزیم دستخوش یک تغییر شکل ساختاری عظیم می‌شود.[4][6]

ساختارهای کریستالی با وضوح بالا که در سال ۲۰۱۴ منتشر شدند، مکانیسم این تغییر را آشکار کردند. همانطور که RNA راهنما با DNA هدف هیبرید می‌شود، پروتئین Cas9 دو دامنه نوکلئازی مجزای خود، یعنی HNH و RuvC را تغییر موقعیت می‌دهد. دامنه HNH در جای خود می‌چرخد تا رشته DNA مکمل RNA راهنما را برش دهد، در حالی که دامنه RuvC رشته غیرمکمل را می‌برد؛ نتیجه این فرآیند، یک شکستگی دو رشته‌ای صاف دقیقاً سه جفت‌باز بالاتر از PAM است.[6]

با این حال، تحمل این سیستم در برابر عدم تطابق‌های ژنتیکی، مانع قابل‌توجهی برای کاربردهای بالینی ایجاد می‌کند. در حالی که ناحیه بذر به مکملیت تقریباً کاملی نیاز دارد، انتهای دورتر توالی ۲۰ نوکلئوتیدی — که در بیشترین فاصله از PAM قرار دارد — اغلب می‌تواند تا سه یا چهار باز نامنطبق را بدون لغو رویداد برش تحمل کند. این انعطاف‌پذیری منجر به اثرات خارج از هدف (off-target) می‌شود، جایی که Cas9 جایگاه‌های ژنومی ناخواسته‌ای را که دارای همولوژی جزئی با هدف هستند، برش می‌دهد.[4]

پژوهشگران بیمارستان عمومی ماساچوست در سال ۲۰۱۴ با تغییر طول خود RNA راهنما، به این مشکل دقت پرداختند. برخلاف انتظار، آن‌ها دریافتند که ارائه اطلاعات هدف‌گیری کمتر به آنزیم، دقت آن را افزایش می‌دهد. این تیم با کوتاه کردن RNA راهنما از ۲۰ نوکلئوتید به ۱۷ یا ۱۸ نوکلئوتید، سیستمی ایجاد کرد که نسبت به عدم تطابق‌ها بسیار حساس‌تر بود.[3]

RNAهای راهنمای کوتاه شده (tru-gRNAs) تنها انرژی اتصالی کافی برای تثبیت کمپلکس Cas9 در زمان تطابق کامل توالی را دارند. اگر حتی یک عدم تطابق رخ دهد، انرژی اتصال کاهش‌یافته برای ایجاد تغییر ساختاری مورد نیاز برای برش کافی نخواهد بود. تیم بیمارستان عمومی ماساچوست گزارش داد که این اصلاح «می‌تواند جهش‌های خارج از هدف را تا ۵۰۰۰ برابر کاهش دهد» در مقایسه با راهنماهای استاندارد ۲۰ نوکلئوتیدی، بدون اینکه کارایی روی هدف قربانی شود.[3]

در حالی که کوتاه کردن RNA راهنما مشکل دقت را حل می‌کند، الزام سخت‌گیرانه NGG PAM محدودیت جداگانه‌ای ایجاد می‌کند: فضای هدف‌گیری. از آنجا که SpCas9 برای شروع اتصال به توالی NGG نیاز دارد، پژوهشگران تنها می‌توانند جایگاه‌هایی را ویرایش کنند که دقیقاً در مجاورت این موتیف قرار دارند. در ژنوم انسان، توالی NGG تقریباً هر هشت جفت‌باز یک بار رخ می‌دهد، که بخش‌های قابل‌توجهی از ژنوم را برای مداخلات استاندارد کریسپر غیرقابل دسترس می‌گذارد.[1][5]

برای غلبه بر این مانع، مهندسان زیستی به جای RNA راهنما، بر جهش دادن خود پروتئین Cas9 تمرکز کرده‌اند. در سال ۲۰۱۸، پژوهشگران واریانتی به نام xCas9 را تکامل دادند که دارای ۱۴ جایگزینی اسید آمینه خاص در دامنه تعامل‌کننده با PAM است. این تغییرات ساختاری به آنزیم اجازه می‌دهد تا مجموعه بسیار گسترده‌تری از توالی‌های PAM، از جمله NG، GAA و GAT را شناسایی کند.[5]

این سازگاری گسترش‌یافته PAM، ریاضیات ویرایش ژنومی را اساساً تغییر می‌دهد. با کاهش محدودیت NGG، واریانت xCas9 فضای هدف‌گیری در دسترس را تقریباً ۴۰۰ درصد افزایش می‌دهد. پژوهشگران خاطرنشان کردند: «xCas9 با شناسایی PAMهای NG، GAA و GAT، فضای هدف‌گیری SpCas9 را گسترش می‌دهد» و عملاً جهش‌های بیماری‌زای پیشتر غیرقابل ویرایش را برای اصلاح مبتنی بر کریسپر باز می‌کند.[5]

ترکیب این دو رویکرد متمایز، یک رابطه معکوس را در بهینه‌سازی کریسپر آشکار می‌کند. اصلاح پروتئین Cas9 تعداد کل جایگاه‌های قابل ویرایش را تا چهار برابر گسترش می‌دهد، اما اصلاح طول RNA راهنما برای فشرده‌سازی نرخ خطای خارج از هدف به میزان سه مرتبه بزرگی ضروری است. کاربردهای بالینی باید هر دو استراتژی را ادغام کنند و واریانت‌های مهندسی‌شده Cas9 را با معماری‌های بهینه‌شده RNA راهنما جفت کنند تا هم به دسترسی گسترده و هم به دقت مطلق دست یابند.[8]

شواهد پشتیبان این مکانیسم‌ها در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) قوی هستند، اما ترجمه این مدل‌های سینتیکی به سلول‌های زنده انسان عدم قطعیت قابل‌توجهی را به همراه دارد. ساختار سه‌بعدی کروماتین — اینکه DNA چقدر محکم به دور پروتئین‌های هیستون پیچیده شده است — می‌تواند به طور فیزیکی مانع از دسترسی Cas9 به یک جایگاه معتبر PAM شود، صرف نظر از توالی RNA راهنما. مدل‌های پیش‌بینی‌کننده در حال حاضر برای در نظر گرفتن این تداخل اپی‌ژنتیکی با مشکل مواجه هستند.[7]

علاوه بر این، نرخ تخریب درون‌سلولی RNA راهنمای مصنوعی همچنان یک متغیر در طراحی درمانی است. اگر sgRNA خیلی سریع تجزیه شود، کارایی ویرایش به شدت کاهش می‌یابد؛ اگر بیش از حد دوام بیاورد، احتمال رویدادهای نادر برش خارج از هدف افزایش می‌یابد. مهندسان زیستی در حال حاضر در حال آزمایش اصلاحات شیمیایی مختلف روی اسکلت RNA هستند تا نیمه‌عمر آن را در بافت انسانی به دقت تنظیم کنند.[2][7]

نقطه بازرسی حیاتی بعدی برای این فناوری در کارآزمایی‌های بالینی فاز I و II در حال انجام برای اختلالات ژنتیکی خون نهفته است. این کارآزمایی‌ها اولین داده‌های قطعی درون‌تنی (in vivo) را در مورد اینکه آیا توالی‌های بهینه‌شده RNA راهنما و واریانت‌های مهندسی‌شده Cas9 می‌توانند بهبودهای ۵۰۰۰ برابری ویژگی خود را هنگام استقرار در میان میلیاردها سلول انسانی حفظ کنند یا خیر، ارائه خواهند داد.[2][8]