رمزگشایی از ژنوم: معماری‌های سنتز، SMRT و نانوپور چگونه DNA را می‌خوانند

لحظه‌ای که یک پلتفرم توالی‌یابی تصمیم به فراخوانی باز (base call) می‌گیرد – یعنی شناسایی آدنین، سیتوزین، گوانین یا تیمین – کل مسیر تحلیل ژنومی را تعیین می‌کند. اینکه این فراخوانی بر اساس یک جرقه فلورسنت، مکث آنزیم پلیمراز، یا یک تغییر میکروسکوپی در جریان الکتریکی باشد، نه تنها دقت خوانش، بلکه نوع سؤالات بیولوژیکی که داده‌ها می‌توانند به آن‌ها پاسخ دهند را مشخص می‌کند.[8]

معماری شرکت Illumina، که به توالی‌یابی با سنتز (SBS) معروف است، متکی بر تصویربرداری نوری است. هنگامی که یک رشته DNA کپی می‌شود، سیستم نوکلئوتیدهایی را وارد می‌کند که مجهز به پایان‌دهنده‌های برگشت‌پذیر و برچسب‌های فلورسنت هستند. وقتی یک باز وارد می‌شود، سنتز موقتاً متوقف می‌شود، یک لیزر برچسب را تحریک می‌کند و یک دوربین رنگ آن را ثبت می‌کند. سپس پایان‌دهنده جدا می‌شود و چرخه تکرار می‌گردد. این روش خوانش‌های کوتاهی تولید می‌کند، معمولاً به طول ۱۵۰ تا ۳۰۰ جفت باز، اما به نرخ دقتی بیش از ۹۹.۹ درصد دست می‌یابد.[1][3]

محدودیت رویکرد SBS در طول خوانش آن نهفته است. ژنوم انسان حاوی مناطق بسیار تکراری است – بخش‌هایی که در آن‌ها یک توالی مشابه هزاران بار تکرار می‌شود. بازسازی این مناطق از قطعات ۳۰۰ جفت بازی، از نظر ریاضی شبیه به کنار هم قرار دادن یک پازل است که آسمان آبی بدون ابر را نشان می‌دهد. قطعات کاملاً به هم می‌خورند، اما موقعیت واقعی آن‌ها مبهم باقی می‌ماند و در نتیجه تغییرات ساختاری و درج‌های بزرگ از دید بالینی پنهان می‌مانند.[3][5]

برای حل مشکل مونتاژ، شرکت Pacific Biosciences (PacBio) توالی‌یابی تک‌مولکولی، بلادرنگ (SMRT) را مهندسی کرد. به جای متوقف کردن سنتز برای گرفتن عکس، توالی‌یابی SMRT یک آنزیم پلیمراز واحد را در کف یک چاهک میکروسکوپی به نام موجبر حالت صفر (ZMW) تثبیت می‌کند. در حالی که آنزیم به طور طبیعی بازهای دارای برچسب فلورسنت را در یک رشته DNA پیوسته وارد می‌کند، ZMW تنها لحظه دقیق ورود را روشن می‌کند و یک فیلم بلادرنگ از سنتز را ثبت می‌نماید.[2][7]

در سال ۲۰۱۹، PacBio توالی‌یابی HiFi را معرفی کرد که اساساً چشم‌انداز دقت را برای خوانش‌های طولانی تغییر داد. با اتصال آداپتورهای سنجاق‌سری به هر دو انتهای یک قطعه DNA دورشته‌ای، مولکول به یک حلقه بسته تبدیل می‌شود. پلیمراز به طور مکرر دور این حلقه حرکت می‌کند و همان توالی ۱۰,۰۰۰ تا ۲۵,۰۰۰ جفت بازی را چندین بار می‌خواند. مستندات فنی ۲۰۲۴ PacBio بیان می‌کند: «توالی‌یابی HiFi هم دقت بالای خوانش‌های کوتاه و هم طول خوانش‌های طولانی مورد نیاز برای مونتاژ ژنوم‌های پیچیده را فراهم می‌کند»، و اشاره می‌کند که اجماع این عبورهای چندگانه به دقت ۹۹.۹ درصد می‌رسد.[2][7]

شرکت Oxford Nanopore Technologies سنتز را به طور کامل کنار می‌گذارد و در عوض بر بیوفیزیک تکیه می‌کند. یک نانوپور پروتئینی در یک غشای مصنوعی مقاوم در برابر جریان الکتریکی تعبیه شده است. یک پروتئین موتوری یک رشته DNA واحد را با سرعت کنترل‌شده از طریق این منفذ عبور می‌دهد. هنگامی که DNA از آن عبور می‌کند، به طور فیزیکی جریان یون‌ها را در سراسر غشا مسدود می‌کند و اختلالی در جریان الکتریکی ایجاد می‌نماید.[4]

از آنجا که هر ترکیب نوکلئوتیدی شکل فیزیکی متمایزی دارد، یک امضای الکتریکی منحصر به فرد ایجاد می‌کند. الگوریتم‌ها این نوسانات جریان را به فراخوانی بازها ترجمه می‌کنند. این معماری هیچ محدودیت شیمیایی بر طول خوانش اعمال نمی‌کند؛ اگر یک مولکول DNA دست‌نخورده استخراج شود، نانوپور آن را خواهد خواند. پلتفرم‌های نانوپور با موفقیت خوانش‌های پیوسته‌ای بیش از ۲ میلیون جفت باز تولید کرده‌اند که به محققان اجازه می‌دهد تا کل سانترومرها را در یک بار عبور پوشش دهند.[4][8]

مصالحه در توالی‌یابی نانوپور از لحاظ تاریخی دقت بوده است. از آنجا که سیگنال الکتریکی تحت تأثیر چندین باز قرار می‌گیرد که به طور همزمان در نانوپور ساکن هستند، الگوریتم‌های فراخوانی باز باید سیگنال‌های پیچیده و همپوشان را از هم تفکیک کنند. در حالی که نسخه‌های اولیه با نرخ خطای بالای ۱۰ درصد دست و پنجه نرم می‌کردند، فراخواننده‌های باز مدرن مبتنی بر شبکه‌های عصبی، دقت خام را به محدوده ۹۵ تا ۹۹ درصد رسانده‌اند، اگرچه هنوز از استاندارد سخت‌گیرانه ۹۹.۹ درصدی روش‌های مبتنی بر سنتز عقب‌تر است.[4][5]

با این حال، اندازه‌گیری فیزیکی مستقیم نانوپور یک مزیت بالینی منحصر به فرد ارائه می‌دهد: تشخیص اپی‌ژنتیک. تغییرات شیمیایی در DNA، مانند متیلاسیون، شکل فیزیکی نوکلئوتید را تغییر می‌دهند و در نتیجه امضای الکتریکی آن را عوض می‌کنند. یک ارزیابی اخیر MDPI که پلتفرم‌های Illumina و Nanopore را برای مطالعه بیماری آلزایمر و زوال عقل فرونتوتمپورال مقایسه می‌کرد، این قابلیت را برجسته ساخت.[6]

محققان MDPI دریافتند که در حالی که Illumina برای تشخیص متیلاسیون نیاز به تبدیل سخت بی سولفیت دارد – فرآیندی که DNA را تخریب کرده و آماده‌سازی کتابخانه را پیچیده می‌کند – توالی‌یابی نانوپور نشانه‌های متیلاسیون را مستقیماً از رشته DNA بومی می‌خواند. این امر اجازه می‌دهد تا یک اجرای توالی‌یابی واحد، هم توالی ژنتیکی و هم تغییرات اپی‌ژنتیکی را به طور همزمان ثبت کند و بافت بیولوژیکی نمونه را حفظ نماید.[6]

شواهد نشان می‌دهد که در حال حاضر هیچ پلتفرم واحدی تمام الزامات ژنومی را برآورده نمی‌کند. Illumina همچنان استاندارد فراخوانی واریانت با توان عملیاتی بالا و کم‌هزینه در انکولوژی (سرطان‌شناسی) باقی مانده است. PacBio HiFi معماری انتخابی برای حل تغییرات ساختاری پیچیده و تولید ژنوم‌هایی با کیفیت مرجع است. Oxford Nanopore بر نظارت سریع پاتوژن‌ها، داربست‌بندی فوق‌طولانی و پروفایل‌سازی مستقیم اپی‌ژنتیک تسلط دارد.[3][5][8]

آستانه بعدی در شیمی ژنومی، یک توالی‌یاب جهانی واحد نیست، بلکه ادغام محاسباتی بدون درز هر سه سیگنال است. هنگامی که یک خط لوله نرم‌افزاری واحد بتواند به طور همزمان جرقه‌های فلورسنت سنتز، زمان‌بندی پلیمراز به دام افتاده، و مقاومت الکتریکی یک نانوپور پروتئینی را پردازش کند، ژنوم سرانجام دقیقاً همان‌طور که عمل می‌کند، خوانده خواهد شد.[8]