چگونه روش‌های جدید، دهه‌ها بافت انسانی آرشیو شده را برای تحلیل تک‌سلولی قابل دسترس می‌کنند

بیش از یک قرن است که بیمارستان‌ها و آزمایشگاه‌های پاتولوژی در سراسر جهان، بافت انسانی را با غوطه‌ور کردن در فرمالدئید و جاسازی در موم پارافین حفظ می‌کنند. این فرآیند روتین بافت‌شناسی، آرشیوهای جهانی عظیمی شامل میلیون‌ها نمونه بیولوژیکی از بیماران مبتلا به سرطان، بیماری‌های التهابی و سایر شرایط را ایجاد کرده است. این بلوک‌های FFPE (تثبیت شده با فرمالین، جاسازی شده در پارافین) به طرز شگفت‌انگیزی پایدار هستند و می‌توانند برای دهه‌ها در دمای اتاق نگهداری شوند، در حالی که ساختار مورفولوژیکی بافت را برای بررسی میکروسکوپی کاملاً حفظ می‌کنند. با این حال، همان فرآیند شیمیایی که ساختار فیزیکی بافت را حفظ می‌کند، به عنوان یک قفل مولکولی عمل می‌کند. تثبیت با فرمالین پیوندهای متقاطع گسترده‌ای بین پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک ایجاد می‌کند که سلول را تثبیت می‌کند اما مولکول‌های شکننده RNA درون آن را به شدت تخریب و تکه‌تکه می‌کند. برای دهه‌ها، این آسیب شیمیایی این آرشیوهای ارزشمند را از پیشرفته‌ترین فناوری‌های ژنومی دور نگه داشته و محققان را مجبور کرده است که تقریباً منحصراً برای پروفایل‌سازی مولکولی با وضوح بالا به بافت تازه تکیه کنند.[2]

این تخریب از لحاظ تاریخی آرشیوهای FFPE را با توالی‌یابی RNA تک‌سلولی مدرن (scRNA-seq) ناسازگار کرده است. فناوری‌های سنتی scRNA-seq، که درک ما از ناهمگونی سلولی را متحول کرده‌اند، برای گرفتن مولکول‌های RNA دست‌نخورده، به شدت به بافت تازه یا منجمد شده نیاز دارند. این روش‌های مرسوم به طور خاص به گرفتن دم‌های پلی-A (Poly-A tails) RNA پیام‌رسان متکی هستند تا یک پروفایل رونویسی کامل از یک سلول منفرد تولید کنند. از آنجایی که تثبیت با فرمالین این دم‌های پلی-A را از بین می‌برد و رشته‌های RNA را تکه‌تکه می‌کند، اعمال توالی‌یابی تک‌سلولی استاندارد بر روی بافت FFPE منجر به از دست رفتن گسترده داده‌ها، کارایی پایین در جذب و نویز فنی طاقت‌فرسا می‌شود. در نتیجه، محققان نتوانسته‌اند میلیون‌ها نمونه با حاشیه نویسی بالینی که در بخش‌های پاتولوژی ذخیره شده‌اند را به صورت گذشته‌نگر تحلیل کنند، و شکاف بزرگی بین داده‌های بالینی تاریخی و قابلیت‌های ژنومی مدرن باقی مانده است.[1][3]

اخیراً، موجی از پیشرفت‌های روش‌شناختی شروع به دور زدن این محدودیت‌های شیمیایی کرده و به طور مؤثری قفل آرشیوهای FFPE را باز کرده است. روش‌های توالی‌یابی جدید به جای تکیه بر دم‌های شکننده پلی-A، از هیبریداسیون پروب هدفمند یا رونویسی معکوس مبتنی بر پرایمر تصادفی برای گرفتن RNA تکه‌تکه شده استفاده می‌کنند. با به کارگیری پروب‌های شیمیایی تخصصی که مستقیماً به توالی‌های کوتاه و خاص RNA در سلول‌های حفظ شده متصل می‌شوند، این روش‌ها می‌توانند یک پروفایل رونویسی بسیار حساس را حتی از بلوک‌های آرشیوی به شدت تخریب شده بازسازی کنند. این تغییر از گرفتن کل رونویسی به هیبریداسیون پروب هدفمند، به دانشمندان اجازه می‌دهد تا داده‌های تک‌سلولی معناداری را بدون نیاز به رشته‌های RNA کاملاً دست‌نخورده استخراج کنند، و اساساً کاربرد نمونه‌های پاتولوژی حفظ شده را تغییر می‌دهد.[2]

یکی از مهم‌ترین پیشرفت‌ها در این زمینه، بازیابی سلول‌های کامل و دست‌نخورده از بافت FFPE به جای صرفاً جداسازی هسته سلول است. تلاش‌های قبلی برای توالی‌یابی بافت حفظ شده اغلب به استخراج تنها هسته متکی بود، زیرا در برابر آسیب‌های نگهداری مقاوم‌تر است. با این حال، جداسازی هسته، سیتوپلاسم را دور می‌اندازد و مقدار قابل توجهی از RNA و اطلاعات بیولوژیکی را با خود می‌برد. پروتکل‌های تفکیک جدید اکنون طراحی شده‌اند تا سلول‌های کامل را به آرامی از ماتریکس پارافین آزاد کنند و در عین حال از دست دادن مواد سیتوپلاسمی را به حداقل برسانند. با بازیابی کل سلول، محققان می‌توانند RNA سیتوپلاسمی را در کنار RNA هسته‌ای توالی‌یابی کنند، یک پروفایل رونویسی بسیار غنی‌تر را ثبت کرده و با موفقیت انواع سلول‌های نادر – مانند نوتروفیل‌ها و آدیپوسیت‌ها – را شناسایی کنند که جداسازی هسته به تنهایی معمولاً آن‌ها را از دست می‌دهد.[2]

شواهد حمایت کننده از این روش‌های جدید توالی‌یابی FFPE قانع کننده است، اما با محدودیت‌های فنی شفافی همراه است. در حالی که روش‌های مبتنی بر پروب در شناسایی انواع سلول‌ها و مسیرهای کلی بیان ژن، تطابق عالی با بافت تازه دارند، ذاتاً توسط پروب‌های خاص موجود در سنجش محدود می‌شوند. از آنجایی که محققان باید توالی‌های RNA مورد نظر خود را از قبل تعریف کنند، این رویکردهای هدفمند ممکن است رونویسی‌های جدید یا تغییرات ژنتیکی غیرمنتظره‌ای را که یک روش واقعی توالی‌یابی کل رونویسی می‌تواند ثبت کند، از دست بدهند. علاوه بر این، تحلیل محاسباتی این داده‌ها نیازمند کنترل کیفیت دقیق است تا سیگنال‌های بیولوژیکی واقعی را از جهش‌های ساختگی و نرخ‌های بالای از دست رفتن داده ناشی از پیوندهای متقاطع اولیه فرمالین متمایز کند.[2][3]

علاوه بر این، سن فیزیکی بلوک FFPE و نوع خاص فرمالین مورد استفاده در طول نگهداری اولیه می‌تواند به طور قابل توجهی بر کیفیت RNA بازیابی شده تأثیر بگذارد. مطالعات نشان می‌دهند که اگرچه DNA و RNA را می‌توان از بلوک‌های چند ده ساله استخراج کرد، نمونه‌های قدیمی‌تر از ده سال اغلب داده‌هایی با کیفیت به مراتب پایین‌تر ارائه می‌دهند، که یک متغیر عدم قطعیت را در مطالعات گذشته‌نگر بلندمدت ایجاد می‌کند. مدت زمان تثبیت اولیه با فرمالین – که معمولاً بین ۶ تا ۲۴ ساعت متغیر است – نیز نقش حیاتی ایفا می‌کند؛ تثبیت بیش از حد می‌تواند آسیب مولکولی برگشت‌ناپذیری ایجاد کند، در حالی که تثبیت کمتر از حد در متوقف کردن تخریب سلولی شکست می‌خورد. این متغیرها به این معنی است که هر بلوک آرشیو شده‌ای داده‌های تک‌سلولی قابل استفاده‌ای را ارائه نخواهد داد و محققان را ملزم می‌کند که گروه‌های تاریخی خود را با دقت غربالگری کنند.[2]

با وجود این محدودیت‌های فنی، توانایی انجام توالی‌یابی تک‌سلولی بر روی بافت FFPE نشان‌دهنده یک تغییر پارادایم در تحقیقات زیست‌پزشکی است. ارزش واقعی این آرشیوها در حاشیه‌نویسی‌های بالینی آن‌ها نهفته است. برخلاف بافت تازه‌ای که امروزه جمع‌آوری می‌شود، بلوک‌های FFPE آرشیو شده دارای دهه‌ها سابقه مستند بیمار، از جمله پیشرفت بیماری، پاسخ‌های درمانی و نتایج نهایی بقا هستند. با تبدیل میلیون‌ها بلوک مومی بی‌اثر به مجموعه‌های داده ژنومی فعال، این روش‌های جدید به دانشمندان اجازه می‌دهند تا پروفایل‌های مولکولی با وضوح بالا را مستقیماً به مسیرهای بالینی دنیای واقعی متصل کنند. این امر دسترسی بی‌سابقه‌ای به پاتولوژی‌های نادر و مراحل طولی بیماری فراهم می‌کند که جمع‌آوری آن‌ها به صورت آینده‌نگر تقریباً غیرممکن است، و توسعه پزشکی دقیق مبتنی بر بافت‌های انسانی که قبلاً غیرقابل دسترس بودند را تسریع می‌بخشد.[1][2]

انتظار می‌رود با بلوغ این فناوری‌ها، ادغام توالی‌یابی تک‌سلولی با نمونه‌های پاتولوژی آرشیو شده، تحقیقات ژنومی را دموکراتیزه کند. مطالعات بافت تازه نیازمند هماهنگی لجستیکی پیچیده بین اتاق‌های عمل و آزمایشگاه‌های توالی‌یابی است، که از لحاظ تاریخی این تحقیقات را به مراکز دانشگاهی با منابع کافی محدود می‌کرد. روش‌های سازگار با FFPE این محدودیت زمانی واقعی را از بین می‌برند و به آزمایشگاه‌ها در سراسر جهان اجازه می‌دهند تا نمونه‌ها را با استفاده از بایوبانک‌های موجود و با سرعت خود توالی‌یابی کنند. با پر کردن شکاف بین یک قرن پاتولوژی سنتی و لبه پیشروی ژنومیک تک‌سلولی، محققان سرانجام آماده‌اند تا تاریخچه مولکولی قفل شده در موم را بخوانند.[2][3]