مکانیک ویرایش ژن: مقایسه کریسپر-کَس۹، تالِن‌ها و زد‌اف‌ان‌ها برای دقت، کارایی و ریسک خارج از هدف

در سال ۲۰۱۲، معرفی کریسپر-کَس۹ مهندسی ژنتیک را از یک فرآیند طاقت‌فرسا و چند ماهه به عملیاتی تبدیل کرد که می‌توانست در عرض چند روز انجام شود. نکته عملی برای هر کسی که بخش بیوتکنولوژی را دنبال می‌کند این است که «بهترین» ابزار ویرایش ژن کاملاً به کاربرد مورد نظر بستگی دارد.[3]

اگرچه کریسپر به دلیل سرعت و کارایی هزینه‌ای در تحقیقات با توان عملیاتی بالا غالب است، نوکلئازهای قابل برنامه‌ریزی قدیمی‌تر—به ویژه نوکلئازهای انگشت روی (ZFNs) و نوکلئازهای افکتور مانند فعال‌کننده رونویسی (TALENs)—برای درمان‌های بالینی خاص ضروری باقی مانده‌اند. برای درک دلیل آن، باید به مکانیسم عملکردی آن‌ها نگاه کنید.[6][7]

هر سه سیستم نوکلئازهای قابل برنامه‌ریزی هستند، به این معنی که مانند قیچی‌های مولکولی عمل می‌کنند که برای برش DNA در یک مکان مشخص طراحی شده‌اند. تفاوت اساسی در نحوه یافتن آن هدف است. زد‌اف‌ان‌ها و تالِن‌ها برای یافتن توالی صحیح DNA به مهندسی پیچیده پروتئین متکی هستند، در حالی که کریسپر از یک قطعه ساده آران‌ای راهنما استفاده می‌کند.[1][8]

نوکلئازهای انگشت روی (ZFNs) اولین پیشرفت بزرگ در ویرایش هدفمند بودند. آن‌ها یک دامنه اتصال به DNA ساخته شده از پروتئین‌های انگشت روی را با یک دامنه برش‌دهنده DNA به نام فوک‌آی (FokI) ادغام می‌کنند. هر انگشت روی دقیقاً سه جفت باز DNA را شناسایی می‌کند. با کنار هم قرار دادن آن‌ها، محققان می‌توانند توالی‌های خاصی را هدف قرار دهند.[1]

با این حال، مهندسی پروتئین به طور بدنامی دشوار است و زد‌اف‌ان‌ها اغلب دچار اثرات خارج از هدف بالایی می‌شوند—یعنی برش DNA در مکان‌های ناخواسته. با وجود این معایب، زد‌اف‌ان‌ها یک مزیت مکانیکی بزرگ دارند: آن‌ها از نظر فیزیکی کوچک هستند.[2]

این اندازه جمع‌وجور بسته‌بندی آن‌ها را در وکتورهای ویروسی برای انتقال به سلول‌های انسانی بسیار آسان‌تر می‌کند، که یک عامل حیاتی برای ژن‌درمانی‌های درون‌تنی (in vivo) است. هنگامی که فضای بارگیری به شدت محدود است، زد‌اف‌ان‌ها مسیری عملی را ارائه می‌دهند.[5]

تالِن‌ها به عنوان نسل دوم ابزارهای ویرایش ظهور کردند و مشکل دقت زد‌اف‌ان‌ها را حل نمودند. به جای اتصال همزمان به سه جفت باز، هر دامنه افکتور مانند فعال‌کننده رونویسی (TALE) یک نوکلئوتید واحد را شناسایی می‌کند. این شناسایی یک به یک، تالِن‌ها را بسیار پیمانه‌ای (ماژولار) و فوق‌العاده دقیق می‌سازد.[3]

در بسیاری از زمینه‌های درمانی، تالِن‌ها فعالیت خارج از هدف به مراتب کمتری نسبت به کریسپر-کَس۹ نشان می‌دهند، و این امر آن‌ها را به انتخاب ارجح تبدیل می‌کند، به خصوص زمانی که یک برش اشتباه می‌تواند باعث سرطان یا سایر عوارض شدید شود. آن‌ها ابزارهای دقیقی هستند که برای محیط‌های با تحمل صفر طراحی شده‌اند.[6][9]

مشکل اصلی تالِن‌ها اندازه مولکولی عظیم آن‌هاست. از آنجایی که آن‌ها برای هر جفت باز هدف، به یک ساختار پروتئینی بزرگ نیاز دارند، انتقال آن‌ها به سلول‌ها یک کابوس لجستیکی است. آن‌ها اغلب از ظرفیت بارگیری وکتورهای استاندارد ویروسی وابسته به آدنو (AAV) که در آزمایش‌های بالینی استفاده می‌شوند، فراتر می‌روند.[6][10]

سپس کریسپر-کَس۹ وارد شد. کریسپر به جای نیاز به یک پروتئین سفارشی‌سازی شده برای یافتن هدف، از یک آران‌ای راهنمای قابل تنظیم (gRNA) استفاده می‌کند که نوکلئاز کَس۹ را مستقیماً به توالی DNA منطبق هدایت می‌کند. این مکانیسم هدایت‌شده توسط آران‌ای همان چیزی است که کریسپر را انقلابی می‌سازد.[4]

طراحی یک آران‌ای راهنمای جدید تنها چند روز طول می‌کشد و کسری از هزینه‌ای را دارد که برای مهندسی یک پروتئین TALE یا انگشت روی سفارشی لازم است. کریسپر همچنین امکان چندگانه‌سازی (multiplexing) را فراهم می‌کند—استفاده همزمان از چندین آران‌ای راهنما برای ویرایش چندین ژن مختلف. این قابلیت تحقیقات پایه و کشف دارو را به شدت تسریع کرده است.[3][7][8]

با این حال، کریسپر محدودیت‌های مکانیکی سخت‌گیرانه‌ای دارد. آنزیم کَس۹ برای اتصال، به یک موتیف مجاور پروتواسپیسر (PAM)—یک توالی کوتاه DNA خاص—نیاز دارد که درست در کنار محل هدف قرار گیرد. اگر ژن هدف فاقد توالی PAM نزدیک باشد، کَس۹ نمی‌تواند متصل شود و محققان مجبور به جستجوی آنزیم‌های جایگزین می‌شوند.[4]

علاوه بر این، اتکای کریسپر به هیبریداسیون آران‌ای-دی‌ان‌ای گاهی اوقات می‌تواند بیش از حد سهل‌گیر باشد و منجر به برش خارج از هدف شود، اگر آران‌ای راهنما با توالی‌ای برخورد کند که شباهت نزدیکی دارد اما کاملاً منطبق نیست. این یک مانع مهم برای تأیید نظارتی در درمان‌های انسانی است.[4]

برای بیوتکنولوژی تجاری و محققان بالینی، این انتخاب یک بده‌بستان محاسبه‌شده است. اگر هدف غربالگری سریع یا اصلاح کشاورزی باشد، سرعت و کارایی هزینه‌ای کریسپر برنده است. اما اگر هدف یک ژن‌درمانی انسانی بسیار هدفمند باشد که در آن دقت حرف اول را می‌زند و محل هدف فاقد توالی PAM مناسب است، تالِن‌ها اغلب مشخصات ایمنی لازم را فراهم می‌کنند، البته به شرطی که چالش‌های انتقال برطرف شوند.[6][9][10]

در نهایت، جعبه ابزار ویرایش ژن در حال گسترش است، نه ادغام. با بهبود مکانیسم‌های انتقال و کشف نوکلئازهای جدید، زد‌اف‌ان‌ها، تالِن‌ها و کریسپر همچنان در کنار هم کار خواهند کرد و هر کدام جایگاه مکانیکی خاصی را که برای آن ساخته شده‌اند، پر می‌کنند.[10]