دانشمندان سیستم کریسپر را کوچک کردند تا ویرایش دقیق ژن در داخل بدن ممکن شود

سال‌هاست که مانع اصلی در درمان بیماری‌های ژنتیکی، نه خود شیمی ویرایش، بلکه اندازه فیزیکی ابزارها بوده است. سیستم‌های سنتی کریسپر-Cas9 به سادگی بیش از حد بزرگ هستند که در حامل‌های استاندارد انتقال ویروسی که برای رساندن درمان‌ها به داخل بدن انسان استفاده می‌شوند، جا بگیرند.

اکنون، یک تیم تحقیقاتی چندمؤسسه‌ای یک نوکلئاز کریسپر مینیاتوری به نام Al3Cas12f را مهندسی کرده است که تقریباً یک سوم اندازه Cas9 است. این پیشرفت که جزئیات آن در مجله Nature Structural & Molecular Biology منتشر شده است، یک مانع حیاتی را برای ویرایش ژن سیستمیک و درون‌تنی (in vivo) برطرف می‌کند.[1][2]

این گلوگاه بر روی وکتورهای ویروسی مرتبط با آدنو (AAV) متمرکز است، که ایمن‌ترین و پرکاربردترین پلتفرم انتقال برای ژن‌درمانی محسوب می‌شوند. AAVها محدودیت بارگیری سختی در حدود ۴.۷ کیلوباز دارند. یک سیستم استاندارد کریسپر-Cas9، همراه با عناصر تنظیمی لازم و RNAهای راهنما، به بیش از ۶.۲ کیلوباز ماده ژنتیکی نیاز دارد.

این عدم تطابق اندازه، صنعت را مجبور کرده است که به شدت به درمان‌های برون‌تنی (ex vivo) متکی باشد—یعنی استخراج سلول‌های بیمار، ویرایش آن‌ها در آزمایشگاه، و تزریق مجدد آن‌ها—فرآیندی که پرهزینه است و درمان را به بافت‌های قابل دسترس مانند خون و مغز استخوان محدود می‌کند.[4][6]

برای دور زدن این محدودیت، محققان دانشگاه تگزاس در آستین، با بودجه مؤسسات ملی بهداشت (NIH)، با شرکت بیوتکنولوژی Metagenomi Therapeutics همکاری کردند. آن‌ها نوکلئازهای باکتریایی طبیعی را بررسی کردند تا جایگزینی فشرده پیدا کنند. آن‌ها Al3Cas12f را شناسایی کردند، آنزیمی که به اندازه کافی کوچک است تا به راحتی در یک وکتور AAV واحد بسته‌بندی شود. با این حال، مانند بسیاری از نوکلئازهای مینیاتوری کشف شده در طبیعت، کارایی ویرایش اولیه آن در سلول‌های پستانداران برای استفاده درمانی بسیار پایین بود.[2][3]

برای درک اینکه چرا آنزیم‌های فشرده اغلب در سلول‌های انسانی شکست می‌خورند، تیم از میکروسکوپ الکترونی کرایو (cryo-EM) و یادگیری ماشینی استفاده کرد تا ساختار آنزیم را در حین تعامل با DNA ترسیم کند. داده‌های ساختاری نشان داد که Al3Cas12f به طور طبیعی یک دایمر پایدار با معماری RNA راهنمای بهینه تشکیل می‌دهد. این آنزیم دارای یک رابط فوق‌العاده بزرگ بین اجزای خود است که به آن اجازه می‌دهد یکپارچگی ساختاری را بهتر از سایر ارتوگ‌های Cas12f که قبلاً در مدل‌های موش آزمایش شده بودند، حفظ کند.[2][5]

محققان با استفاده از این طرح ساختاری، پروتئین را به طور سیستماتیک مهندسی کردند تا مکانیک اتصال و برش آن را تقویت کنند. نتیجه، یک نوع بسیار بهینه شده به نام Al3Cas12f RKK بود. به گفته نویسندگان مطالعه، رابط گسترش‌یافته نوع RKK به این معنی است که آنزیم اساساً بلافاصله پس از تولید قطعاتش، به صورت پیش‌مونتاژ شده و آماده کار است، که زمان لازم برای مکان‌یابی و برش DNA هدف را به شدت کاهش می‌دهد.[1][2]

داده‌های عملکردی برای این نوع مهندسی‌شده، جهشی قابل توجه برای سیستم‌های کریسپر فشرده محسوب می‌شود. در آزمایش‌های آزمایشگاهی با استفاده از رده‌های سلولی انسانی، نوع Al3Cas12f RKK کارایی ویرایش را از کمتر از ۱۰٪ به بیش از ۸۰٪ در طیف گسترده‌ای از اهداف ژنومی افزایش داد. در برخی مکان‌های بسیار بهینه شده، کارایی ویرایش به ۹۰٪ رسید که با عملکرد آنزیم‌های Cas9 که بسیار بزرگتر و استاندارد صنعتی هستند، رقابت می‌کند.[1][6]

تیم تحقیقاتی دقت سیستم را با وارد کردن نوع RKK به سلول‌های انسانی که در اصل از یک بیمار مبتلا به لوسمی جدا شده بودند، تأیید کرد. آن‌ها با موفقیت جهش‌های ژنتیکی خاص مرتبط با شرایط شدید، از جمله اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (ALS)، آترواسکلروز و انواع مختلف سرطان را هدف قرار داده و ویرایش کردند. توانایی ویرایش کارآمد این اهداف، تطبیق‌پذیری نوکلئاز را در پروفایل‌های مختلف بیماری نشان می‌دهد.[1][2]

کشف دانشگاه تگزاس در آستین با یک چرخش عظیم صنعتی به سمت ویرایشگرهای ژنی فوق‌فشرده همسو است. داده‌های پیش‌بالینی اخیر از مؤسسات دیگر، سیستم‌های مینیاتوری مشابهی مانند Cas12m را نشان داده‌اند که برای ویرایش اپی‌ژنوم سازگار شده‌اند—یعنی روشن یا خاموش کردن ژن‌ها بدون برش رشته DNA. سرمایه‌گذاری خطرپذیر در پلتفرم‌های ژن‌درمانی سیستمیک افزایش یافته است و سیستم‌های کریسپر فشرده یک نقطه عطف تکنولوژیکی کلیدی را نشان می‌دهند که می‌تواند درمان هزاران بیماری تک‌ژنی را ممکن سازد.[4][7]

با وجود شواهد قوی آزمایشگاهی (in vitro)، موانع مهمی برای انتقال به مرحله بالینی باقی مانده است. داده‌های فعلی کارایی استثنایی را در سلول‌های انسانی کشت‌شده نشان می‌دهند، اما سیستم اکنون باید به صورت درون‌تنی (in vivo) تأیید شود. مرحله حیاتی بعدی نیازمند بسته‌بندی سیستم Al3Cas12f RKK در وکتورهای AAV و اثبات این است که می‌تواند به کارایی ویرایش بالا در محیط‌های بافتی پیچیده مدل‌های حیوانی زنده، مانند کبد، ماهیچه یا مغز دست یابد.[1][6]

علاوه بر این، در حالی که داده‌های ساختاری اولیه نشان‌دهنده ویژگی بالا هستند، توالی‌یابی جامع کل ژنوم برای ترسیم قطعی هرگونه ویرایش خارج از هدف (off-target edits) مورد نیاز خواهد بود. از آنجایی که نوکلئازهای مینیاتوری به مکانیسم‌های اتصال DNA متفاوتی نسبت به Cas9 متکی هستند، مشخصات ایمنی بلندمدت و پتانسیل ایمنی‌زایی آن‌ها هنگام انتقال سیستمیک از طریق AAVها سؤالات باز باقی می‌مانند که باید قبل از در نظر گرفتن آزمایش‌های بالینی انسانی به آن‌ها پاسخ داده شود.[5][6]

اگر آزمایش‌های حیوانی درون‌تنی موفقیت مشاهده شده در رده‌های سلولی انسانی را تکرار کنند، پیامدهای آن برای پزشکی عمیق خواهد بود. یک سیستم کریسپر بسیار کارآمد و سازگار با AAV، ژن‌درمانی را از یک ابزار تخصصی برای اختلالات خونی به یک داروی سیستمیک تبدیل می‌کند که قادر است به قلب، ریه‌ها، مغز و ماهیچه‌ها برسد و به طور بالقوه درمان‌های تک‌دوز را برای بیماری‌هایی که در حال حاضر غیرقابل درمان هستند، ارائه دهد.[1][4]