قیچی مولکولی کریسپر (CRISPR-Cas9) چگونه کار می‌کند؟ مکانیسم ویرایش ژنوم

تصور کنید یک کتابخانه عظیم با سه میلیارد حرف دارید که تنها یک اشتباه املایی در یکی از صفحات آن می‌تواند منجر به یک بیماری کشنده شود. تا یک دهه پیش، پیدا کردن و اصلاح این اشتباه املایی در سلول‌های زنده انسان یک رویای علمی‌تخیلی بود. اما امروزه، به لطف کشف یک مکانیسم دفاعی باستانی در باکتری‌ها، ما ابزاری در اختیار داریم که دقیقاً همین کار را انجام می‌دهد. این ابزار به ما اجازه می‌دهد تا کد منبع حیات را با دقتی بی‌سابقه بازنویسی کنیم.[4]

فناوری CRISPR-Cas9 که جایزه نوبل شیمی سال ۲۰۲۰ را برای توسعه‌دهندگان آن به ارمغان آورد، اکنون قدرتمندترین ابزار ویرایش ژن در جهان است. این سیستم به دانشمندان اجازه می‌دهد تا تغییراتی بسیار دقیق در مکان‌های مشخصی از ژنوم ایجاد کنند. از درمان بیماری‌های نادر ژنتیکی گرفته تا مهندسی محصولات کشاورزی مقاوم در برابر خشکسالی، دامنه کاربردهای این فناوری مرزهای زیست‌شناسی را جابجا کرده است.[3]

برای درک اینکه کریسپر چگونه کار می‌کند، باید به منشأ آن در طبیعت نگاه کنیم. کریسپر در واقع سیستم ایمنی تطبیقی باکتری‌ها و آرکی‌ها در برابر حملات ویروسی (باکتریوفاژها) است. وقتی یک ویروس به باکتری حمله می‌کند، باکتری در صورت زنده ماندن، قطعه کوچکی از DNA ویروس را برش داده و آن را در ژنوم خود ذخیره می‌کند تا در آینده بتواند آن را به یاد بیاورد.[1][2]

این قطعات ذخیره‌شده در بخشی از ژنوم باکتری به نام آرایه کریسپر (CRISPR array) قرار می‌گیرند و به عنوان یک «حافظه ژنتیکی» عمل می‌کنند. اگر همان ویروس در آینده دوباره به باکتری حمله کند، باکتری از این حافظه برای تولید یک RNA راهنما استفاده می‌کند. این RNA راهنما به سرعت ویروس مهاجم را شناسایی کرده و ماشین‌آلات دفاعی باکتری را برای نابودی آن هدایت می‌کند.[2]

سیستم مهندسی‌شده‌ای که امروزه در آزمایشگاه‌ها استفاده می‌شود، از دو جزء اصلی تشکیل شده است: یک آنزیم برش‌دهنده به نام Cas9 (کس۹) و یک مولکول RNA راهنما (gRNA). آنزیم Cas9 مانند یک قیچی مولکولی عمل می‌کند که وظیفه بریدن رشته‌های DNA را بر عهده دارد، در حالی که RNA راهنما مانند یک دستگاه GPS، این قیچی را دقیقاً به محل مورد نظر در ژنوم هدایت می‌کند.[1][4]

فرآیند ویرایش با اسکن کردن ژنوم آغاز می‌شود. آنزیم Cas9 در امتداد رشته‌های DNA حرکت می‌کند و به دنبال یک توالی سه حرفی بسیار کوتاه به نام PAM (Protospacer Adjacent Motif) می‌گردد. بدون وجود توالی PAM، آنزیم Cas9 نمی‌تواند به DNA متصل شود؛ این یک مکانیسم ایمنی طبیعی است که از برش تصادفی ژنوم خود باکتری جلوگیری می‌کند.[2][3]

به محض اینکه Cas9 توالی PAM را پیدا می‌کند، مارپیچ دوگانه DNA را در آن نقطه باز می‌کند. در این مرحله، RNA راهنما وارد عمل می‌شود. اگر توالی ۲۰ حرفی RNA راهنما با توالی DNA باز شده مطابقت کامل (مکمل بودن پایه‌ها) داشته باشد، سیستم در محل قفل می‌شود و آماده برش می‌گردد.[2]

پس از تایید تطابق کامل، آنزیم Cas9 تغییر شکل می‌دهد و دو دامنه برش‌دهنده آن (به نام‌های RuvC و HNH) فعال می‌شوند. این دامنه‌ها هر دو رشته مارپیچ DNA را دقیقاً در سه جفت‌باز قبل از توالی PAM قطع می‌کنند و یک «شکستگی دو رشته‌ای» (Double-Strand Break) در ژنوم ایجاد می‌کنند.[2]

برش دادن DNA تنها نیمی از فرآیند ویرایش است؛ نیمه دوم توسط مکانیسم‌های ترمیم خود سلول انجام می‌شود. وقتی سلول متوجه شکستگی در DNA خود می‌شود، بلافاصله سعی می‌کند آن را تعمیر کند تا از مرگ سلولی جلوگیری کند. یکی از روش‌های اصلی ترمیم، «اتصال غیرهمولوگ انتهای رشته‌ها» (NHEJ) نام دارد.[3][4]

در روش NHEJ، سلول با عجله دو سر شکسته را به هم می‌چسباند. این فرآیند مستعد خطا است و معمولاً باعث اضافه شدن یا حذف شدن چند حرف ژنتیکی در محل برش می‌شود. دانشمندان از این روش برای «خاموش کردن» (Knockout) یک ژن معیوب یا مضر استفاده می‌کنند، زیرا این تغییرات باعث از کار افتادن عملکرد آن ژن می‌شود.[2][4]

روش دوم ترمیم، «ترمیم هدایت‌شده با همولوژی» (HDR) است که بسیار دقیق‌تر عمل می‌کند. در این روش، دانشمندان همراه با سیستم کریسپر، یک قطعه DNA سالم را نیز به عنوان الگو وارد سلول می‌کنند تا سلول از آن برای تعمیر شکستگی استفاده کند.[2]

سلول در هنگام ترمیم شکستگی، از این قطعه الگوی سالم استفاده می‌کند تا شکاف را پر کند. این دقیقاً همان مکانیزمی است که به محققان اجازه می‌دهد تا یک جهش بیماری‌زا را با یک توالی سالم جایگزین کنند، یا به عبارتی، اشتباه املایی ژنتیکی را با دقت یک حرف اصلاح کنند.[3][4]

با وجود دقت بالای کریسپر، یکی از چالش‌های اصلی این فناوری، اثرات خارج از هدف (Off-target effects) است. گاهی اوقات RNA راهنما ممکن است به توالی‌هایی که شباهت زیادی به هدف اصلی دارند متصل شود و Cas9 برش‌های ناخواسته‌ای در بخش‌های دیگر ژنوم ایجاد کند که می‌تواند پیامدهای پیش‌بینی‌نشده‌ای داشته باشد.[2]

محققان در حال توسعه نسخه‌های جدیدتری از آنزیم‌های Cas و سیستم‌های ویرایش پایه (Base editing) هستند که بدون نیاز به ایجاد شکستگی دو رشته‌ای، تنها یک حرف ژنتیکی را به حرف دیگر تبدیل می‌کنند. این پیشرفت‌ها نشان می‌دهد که کریسپر تنها آغاز عصر جدیدی در زیست‌شناسی مولکولی و پزشکی شخصی‌سازی‌شده است.[1][4]